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一、抗原修復(fù)不充分

原因：甲醛固定導(dǎo)致抗原表位交聯(lián)封閉，或修復(fù)液pH值錯(cuò)誤、時(shí)間不足。

解決：

使用pH 6.0檸檬酸鹽緩沖液（多數(shù)抗體適用）。

高壓修復(fù)（121℃, 2~3分鐘）優(yōu)于微波修復(fù)。

二、一抗問(wèn)題

原因：濃度過(guò)低、孵育時(shí)間過(guò)短或抗體失效。

解決：

進(jìn)行濃度梯度測(cè)試（如1:50~1:400）。

設(shè)立陽(yáng)性對(duì)照驗(yàn)證抗體活性。

三、組織固定不當(dāng)

原因：固定時(shí)間過(guò)長(zhǎng)（>48小時(shí)）或固定液濃度過(guò)高。

解決：

推薦10%中性福爾馬林固定6~24小時(shí)。

及時(shí)固定（大標(biāo)本需切開）。

四、操作失誤

原因：組織干燥、切片過(guò)厚或試劑覆蓋不全。

解決：

保持切片濕潤(rùn)，厚度控制在3~4μm。

使用DAKO筆圈畫組織防止液體流失。

五、DAB顯色異常

原因：顯色時(shí)間過(guò)長(zhǎng)或DAB變質(zhì)。

解決：

現(xiàn)配現(xiàn)用DAB，顯色時(shí)間控制在1~5分鐘。

顯微鏡下監(jiān)控顯色過(guò)程。

六、其他因素

內(nèi)源性酶未阻斷：用3% H2O2處理10分鐘（室溫）。

脫鈣組織處理：改用EDTA脫鈣液避免抗原破壞。

若問(wèn)題持續(xù)，建議檢查抗體特異性或重新取樣。